Pengenalan

Prosedur mengenal pasti oosit (OI) adalah proses identifikasi oosit semasa posedur mengumpul oosit matang terus dari cecair folikel dalam ovari wanita. Pengumpulan Oosit adalah teknik yang digunakan dalam persenyawaan in vitro untuk mencari, dan mengutip kompleks kumulus oosit-(COC) dari cecair folikel ovari, membolehkan persenyawaan di luar badan dilakukan. Pesakit menerima rangsangan hormon dalam usaha untuk mendapatkan beberapa oosit matang. Pada masa ini, oosit dikumpul berdasarkan sedutan transvaginal berpandukan ultrabunyi. Dua faktor yang paling penting yang perlu diberi perhatian semasa prosedur pengumpulan oosit  adalah suhu dan pH.

Prosedur Mengenal pasti Oosit

1. Perkara penting yang perlu dilakukan sebelum mengena lpasti oosit ialah menyediakan media kultur kumulus mengandungi oosit, media kultur oosit selepas ICSI, media pengumpulan kumulus oosit dan minyak sehari sebelum OI dan panaskan bahan pakai buang yang akan digunakan untuk pengumpulan oosit ke suhu 37 °C.
2. Sebelum prosedur, periksa pam sedutan dan menetapkan tekanan sedutan untuk -121mmhg dan pemanas tiub pada suhu yang sesuai (37 ± 1 ^oC).
3. Sahkan nama pesakit dan suami dan juga nombor kad pengenalan mereka.
4. Matikan penghawa dingin untuk memastikan suhu bilik adalah sesuai sebaik-baiknya 26-27 ºC.
5. Prosedur bermula sebaik sahaja doktor memasukkan jarum dan sedut cecair folikel dari ovari menggunakan pam sedutan dengan bantuan ultrabunyi. Cecair folikel disedut akan disalorkan terus dari jarum  ke dalam tiub kutipan.
6. Tiub kutipan seterusnya akan diberi kepada embryologis untuk mengenalpasti kumulus oosit di bawah bantuan mikroskop. Setelah kumulus oosit dikenal pasti, basuh kumulus oosit yang dikumpul dalam media pengumpulan, gred mereka dan memaklumkan bilangan yang ditemui dan gred kepada doktor.
7. Selepas prosedur selesai, pindahkan mereka ke dalam media kultur dan kultur mereka selama 4 jam dalam inkubator yang dilengkapi dengan Tri-gas (5% oksigen, 6% karbon dioksida dan 89% nitrogen) untuk kematangan selanjutnya.

Nota: Bilas kumulus oosit dengan media kultur kumulus oosit kerana media yang digunakan untuk mengumpul dan kultur kumulus oosit adalah berbeza.

Rajah 1: A) Menerima sampel dari OT.   B) Ambil sampel.   C) Tuangkan sampel ke piring petri.   D) Semak dan mengenal pasti kumulus oosit bawah mikroskop. E) Memungut kumulus yang mengandungi oosit. F) Bilas dan pindahkan ke dalam piring petri yang mengandungi HEPES. G) Pindahkan ke dalam media kultur cumulus oosit  (Sumber dari HKL).

Penggredan Oosit Semasa OI

Oosit dikelilingi oleh kumulus (COC) pada masa pengumpulan (Rajah 2A). Di bawah stereomikroscope,  pre-ovulatori oosit yang matang biasanya  kelihatan kumulus terpancar dan berkembang dikelilingi oleh sekumpulan sel kumulus yang longgar (Rajah 2B). Pra-penilaian  semasa kena lpasti  oosit bergantung kepada saiz dan warna. Kualiti oosit yang kurang baik biasanya lebih kecil atau berwarna gelap. Kualiti oosit adalah faktor dihadkan oleh kesuburan wanita. Perkembangan embrio adalah sebahagian besarnya ditentukan oleh kualiti oosit. Aspek yang boleh mempengaruhi kualiti oosit boleh dibahagikan kepada morfologi, selular dan molekul. Kualiti oosit kebanyakannya ditentukan oleh morfologi dan prestasinya selepas persenyawaan. Aspek sel dan molekul yang boleh menentukan kualiti oosit belum digunakan dalam rutin harian. Anomali morfologi sering diperhatikan dalam oosit manusia. Selepas IVF, 13% daripada oosit tidak bersenyawa menunjukkan keabnormalan morfologi (Van Blerkom dan Henry, 1992).

Rajah 2: A) Kumulus mengandungi oosit diperhatikan semasa OI. B). Oosit diperhatikan di bawah mikroskop. C) Oosit selepas dibuang Kumulus di bawah mikroskop (Sumber dari HKL).

Pengkulturan Oosit

Kumulus yang mengandungi oosit  biasanya dikultur selama 4 jam selepas prosedur pengumpulan kumulus untuk kematangan selanjutnya. Oosit amat sensitif kepada perubahan suhu. Turun naik suhu mempunyai kesan memudaratkan untuk gelendong meiosis. Gangguan seperti tidak teratur microtubule dalam gelendong, ketumpatan yang menurun microtubule atau kekurangan microtubules, boleh mengganggu pengasingan yang betul kromosom (Pickering et al, 1990;. Wang et al, 2001.). Penyelenggaraan 37 ^o C semasa dalam manipulasi vitro diperlukan. Oleh itu, semua bahan pakai buang dan media yang akan digunakan untuk prosedur OI dipanas kepada 37 ° C. pH intrasel (Phi) oosit adalah sekitar 7.4 semasa kematangan dan persenyawaan. Perubahan pH semasa manipulasi oosit mungkin mempunyai kesan yang memudaratkan, kerana dinamik cytoskeletal dan metabolisme sel amat bergantung kepada pH (Dale, 1998; Swain dan Pool, 2009). Dalam usaha untuk mengelakkan turun naik pH. pH luaran dan juga secara tidak langsung pH intrasel, oosit dikumpulkan dalam HEPES (4- (2-hydroxyethyl )asid sulfonik -1-piperazineethane) buffered pada pH 7.3. Media yang digunakan untuk kultur oosit memerlukan karbon dioksida untuk mengekalkan pH. Oleh itu, media yang digunakan perlu diseimbangkan terlebih dahulu dalam inkubator (Rajah 3). Perubahan osmolariti yang timbul kerana penyejatan mungkin berlaku semasa kultur. Perubahan pada osmolariti menyebab sel oosit mengecut atau bengkak. Penyejatan boleh dielakkan dengan meletakkan satu lapisan minyak ke atas media untuk mengekalkan osmolarity media kultur.

Rajah 3: Inkubator digunakan untuk oosit dan kultur embrio (Sumber dari HKL).

Rujukan

1. Dale B, Menezo Y, Cohen J, DiMatteo L.,Wilding M. Intracellular pH regulation in the human oocyte.Human reproduction. 1998;13:964-970.
2. Pickering SJ, Braude PR , Johnson MH, Cant A, Currie J. Transient cooling to room temperature can cause irreversible disruption of the meiotic spindle in the human oocyte. Fertility steril. 1990;54:102-108.
3. Swain JE and Pool TB. New pH-buffering system for media utilised during gamete and embryo manipulations for assisted reproduction.Reproduction Biomedical Online. 2009;18:799-810.
4. Van Blerkom J, Henry GH. Oocyte dismorphism and aneuploidy in meiotically mature human oocytes after ovarian stimulation.Human Reproduction. 1992; 7: 379–390.
5. Wang WH,Meng L,Hackett RJ,Odenbourg R,Keefe DL. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human reproduction.2001; 16:2374-2378.